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香港回归以后，为了发挥内地资源与特区自由贸易港的优势，香港特区政府于九九年初把特区今后的发展方向定位在数码港和中药港的建设上。其中中药港的建设由香港著名大学——香港中文大学牵头，负责筛选内地及香港中成药并进行国际标准化研究，希望以此为突破口促进中药走向世界。
“国宝名药”片仔癀作为国家一级中药保护品种和中国中药名牌产品，多次蝉联国家金质奖，并多年来位居中国中成药单项出口创汇前列，年出口创汇超千万美元，片仔癀商标还被国家列为中国驰名商标。源于明朝宫廷秘方的片仔癀由于具有消炎、解毒、镇痛的显著功效深受医生和患者的欢迎，畅销海内外市场，享誉蜚然，还获得中国首批原产地标记认证。由于我国传统名贵中成药片仔癀在海外极高的声誉及相关医院的推荐，片仔癀被香港中文大学列为首批研究的品种之一。同年底香港中文大学与漳州片仔癀药业股份有限公司合作，以“片仔癀保肝作用研究”为内容联合向特区政府工业署申请创新基金。特区政府组织专家对申请的项目的临床应用情况进行审查，并向香港的医疗机构发放调查表，了解申请项目的临床作用效果，经过近半年的评审考察，最后于2000年下半年确定两个中药品种由香港政府创新及科技基金无偿提供专项研究资金，这两个中药品种一个是片仔癀，另一个为香港中药品种。中国内地此次仅有一个中成药品种被列入，再次显示了片仔癀不凡的疗效和作为中国中药名牌产品代表的卓绝地位。
此次片仔癀的保肝作用研究始于2000年底，研究总负责为香港中文大学解剖学系、英国皇家生物学院院士姚大卫教授，研究具体负责人为陈活彝博士。通过两年科学研究，结果表明：片仔癀有明显降低转氨酶、保护肝细胞、减少肝细胞坏死、增强机体免疫力作用。由于片仔癀的保肝作用显著，使研究者产生浓厚兴趣，决定深入研究，从分子药理学水平探讨其作用机理，进一步的研究结果表明：片仔癀能促进肝细胞再生因子、肝细胞免疫因子等相关因子的形成，揭示片仔癀的保肝作用主要是通过促进肝细胞再生及增强肝细胞免疫功能来实现的。
片仔癀的保肝研究结果在香港及东南亚引起轰动。随着香港中文大学对片仔癀的最新研究成果在著名国际医学学术期刊丹麦的《药理毒理》杂志上的发表，将对“国宝名药”片仔癀进军欧美市场产生了积极的影响。名贵中成药片仔癀进一步声名远扬，严格的科学研究再一次证明祖国传统医药对肝炎等疑难重症有显著的治疗作用，这也是片仔癀对人类健康事业的又一贡献。 |
片仔癀保护肝脏作用
Kenenth K.H.Lee1,Wing Hang
Kwong1,Foo-tim Chau2,David T.Yew1 and Wood
Yee Chan1
(1：香港沙田香港中文大学医学院解剖学系；2：香港红碪香港理工大学应用生化系)
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摘要：片仔癀，是一种经常用于治疗肝病的中成药。在本次研究中，我们观察到片仔癀具有保护小鼠肝脏，避免四氯化碳引起肝损害的能力。组织解剖学研究表明经四氯化碳处理，会引起小鼠肝脏中心静脉周围的肝细胞大面积衰退性改变。但在用四氯化碳处理之前喂食了0.5毫克片仔癀/克体重的剂量（共3剂量超过36小时）后，超过28%的小鼠这种衰变减轻了。接着观察了片仔癀对肝细胞中的作用，流动分析仪显示片仔癀对肝细胞增殖无明显效果。但发现片仔癀能对肝细胞中重要信号传导途径的各种（表达因子）反应元素产生影响后，进一步观察，发现片仔癀增强了AP1、CRE和NFκB（表达因子）反应元素的表达。这些（表达因子）反应元素的转录因子对机体细胞的生存和死亡起着重要的作用。因此我们推断片仔癀保护肝脏，避免四氯化碳引起肝损害的能力是通过调整这些重要信号传导途径的活性来实现的。
片仔癀是大约公元1555年明王朝明世宗的一位宫廷御医传下来的传统中药，它被用来治疗肝病、癌症和各种炎症，它主要含有三七、牛黄、麝香、蛇胆。尽管在治疗肝病方面，片仔癀得以广泛应用，但在西方文献中没有正式记载它的疗效。由上海医科大学进行的研究中报导（未公开发表）片仔癀用于几种不同小鼠模型的效果：1、在由卡介苗和脂多糖引起的免疫性肝炎模型中，片仔癀能抑制因肝损伤引起血液中ALT和AST的升高。2、在由四氯化碳引起的急性肝炎模型中，片仔癀也会降低血清ALT和AST水平。3、在由环磷酰胺处理的小鼠模型中，它能增加溶血素的活性和脾淋巴细胞的转化、增殖能力。4、片仔癀能抑制巨噬细胞产生白介素Ⅰ，但对淋巴细胞产生白介素Ⅱ无影响。中国政府已将片仔癀列为国宝之一。
最近我们研究了片仔癀治疗四氯化碳引起的肝损伤效果。通常四氯化碳引起的肝损伤模型是用来研究传统中药的保肝作用最有效的动物实验模型。我们用这种实验模型来研究四氯化碳肝损伤产生的组织学变化和片仔癀的治疗效果。我们也应用分子技术测试片仔癀对肝细胞中重要信号传导途径的影响作用。我们先研究了不同细胞中不同基因的功能。从文献中我们知道这是传导描述技术第一次用来研究传统中药的作用。片仔癀影响细胞增殖能力也用细胞培养和流体分析检测出来。
材料和方法
用于动物和体外研究的片仔癀样品的准备 片仔癀从漳州片仔癀药业股份有限公司得到并经过鉴定。片仔癀样品使用被预先处理成0.1克片仔癀粉溶于2毫升双重蒸馏水中的溶液。当粉末完全溶解溶液变清时，样品开始准备灌服。在HPLC和GC-MS研究中，样品分别溶于乙醚和乙醇中。
片仔癀的HPLC研究 约两克的片仔癀样品应用索氏提取方法用150毫升乙醚提取两小时。滤去残渣后，溶液用旋转蒸发器蒸去乙醚，残渣溶于10毫升乙腈中。样品通过SEP-PAK
C18药柱后，取20μl样品注入HPLC设备，检测设备是HP 1100型。测试峰是设在204nm。流动相由32.5%的乙腈和67.5%
0.1M NH4H2PO4组成，流速1.0ml/min。
片仔癀的GC-MS研究 约0.5g片仔癀粉置于超声波缸内用4ml乙醇超声波提取1小时。分离上清液。溶剂用德国默克公司的分析纯试剂。分析仪器用Helwlett-Packard的GC
HP5890系列5973型分光光度计。色谱柱用的是带厚度0.25μm膜的HP-5MS柱（30m±0.25mm）。氦气作为载体，并且柱温在200°保持15min。注射器和检测器分别维持在230°和280°。主体选择检测器置于四极模式。
实验小鼠组和对照小鼠组 在片仔癀+CCl4实验组中，ICR随机抽取年轻成年小鼠（2-3月大）用灌胃法36小时内灌服0.5mg片仔癀/g体重3次，如：每12小时灌服一次。第36小时（灌服第3剂量片仔癀），小鼠再腹腔注射2μg
CCl4/体重。CCl4溶解于玉米油中（体积比1:1）。第48小时，再灌服1次片仔癀。灌服最后一剂片仔癀后12小时（即第60小时），小鼠以断颈采血处死，并立即取出它们的肝脏，做为进一步实验所用。在CCl4实验组，年轻成年小鼠用灌胃法灌服20μl蒸馏水以代替片仔癀，也是48小时内灌4次（如12小时一次）。同样第36小时（或灌服第3剂蒸馏水时）腹腔注射2μg
CCl4/g体重。有三组对照组，在空白对照组中小鼠未作任何处理；在片仔癀对照组中小鼠只在48小时内灌服4次0.5mg片仔癀/g体重并灌服最后一剂量后12小时处死；在溶媒对照组中，小鼠仅被腹腔注射0.2ml玉米油（CCl4的溶媒）并在注射后24小时处死。每一实验组和对照组都应有至少20只小鼠。
组织学的制备 第2天早晨，肝脏被切成中间、中央和侧面部位。每部位再切成约1cm3的小块，并立即在10%福尔马林液中浸泡固定至少一天。接着这些组织小块在一系列逐级上升的酒精中脱水，并随后在二甲苯中清洗，再包埋于石蜡中用切片机切成5μm厚的切片。
细胞核的计数 由苏木素和伊红染色过的切片在放大倍数400倍的显微镜下观察，可以明显鉴别出正常细胞核和含有染色体凝聚碎片的异常细胞核。正常细胞核和异常细胞核的数量是由两位独立的观察者计数，由联接在一台显微镜上的电脑上的运行软件“立体调查者”（MicroBrightField,Inc.,Colchester,VT,USA）统计数目。每组至少随机抽取10只小鼠，每只小鼠至少随机抽取10个切片进行细胞核计数。每个切片最好能由软件随机选取9-12个面积为100μm×100μm的计数区。每片切片计数区的数目（9-12个）由软件自动最优化选取。每实验组的异常细胞核的比例（异常细胞核的数目/总细胞核的数目×100%）随即计算出来。
肝功能的评价 血样从空白组、CCl4组、片仔癀+CCl4组的小鼠得到。血样在2000rpm离心10分钟，分离血清。ALT酶活性由InfinityTM
ALT试剂（Sigma,St.Louis,MO,USA）测试，由一台特殊分光光度计测量。
细胞培养 肝细胞株（H358）从香港中文大学解剖系得到。细胞配成浓度2×106个细胞/ml，后用聚L-赖氨酸包埋，接种于4孔的组织培养盘中。细胞维持在溶媒由Dulbecco的变性伊格氏培养基+10%FBS组成的浓度为0-1000μg/ml的片仔癀溶液中，在5%的CO2和温度37°中培养。细胞经72小时培养后收集。在传导信号描绘实验中，细胞被接种在96孔的培养盘中。
细胞增殖分析 在0-1000μg/ml片仔癀溶液中培养的细胞在含有0.1%胰蛋白酶和1mM
EDTA的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中37°下溶解2-5分钟后从培养盘中分离出来。分离出来的细胞立即在2%冰的三聚甲醛PBS溶液中混合2小时。流动分析由Coulter
EPOC ALTRA 流动细胞计数器（Beckman Coulter）执行。所有数据由EXPO
V.2 细胞计数器软件和MODFIT软件分析。
SEAP报导器分析 片仔癀对肝细胞传导作用的描述是由MercuryTM
Pathway Profiling系统（Clontech）。增强元素：AP-1、NFκB、E-box、CRE、GRE和HSE。这些元素的作用是联系TAL启动因子和分泌碱性磷酸酶分析器（SEAP）。构成物用LipofectAMINETM2000(LF2000,生物工程)。将混有50μl
DMEM培养剂和0.4μl LF2000的300μg每一载体构成物导入含有肝细胞的96孔培养盘的每一分室。24小时后转染物移走，加入新鲜的含有0-500μg/ml片仔癀的DMEM培养剂。经48小时培养，从96孔培养盘的每一孔中收集25μl上清液。一台SEAP
Detection KIT检测仪被用来检测上清液中碱性磷酸酶的浓度。所有分析在一个96孔平底微量滴定盘上进行。每25μl上清液加入25μl稀释缓冲液轻轻混合。混合物在65°培养30分钟。接着样品中加入3μl
1mM MUP，再培养60分钟。SEAP活性用一台Victor-2 Multilabet (EG&G
WALLAC)计数器在360nm测量。作为正面操作，一些肝细胞用NFκB反应元素转染，接着用400ng/ml姜黄素处理。Singh&Aggarwal（1995）知道姜黄素能抑制NFκB转录活性。
结 果
Fig.1. (a)片仔癀样品在204nm测量的HPLC图谱 (b)片仔癀样品GC-MS光谱
片仔癀样品的标定 片仔癀样品用HPLC和GC-MS两种方法分析。通过HPLC研究中波长变化可以发现其吸收度最大是在204nm，因此用204nm作为色谱分析的波长。HPLC色谱法在204nm（见fig.
1a）显示在滞留时间为2.043、2.995、3.717、6.325和15.709分钟有5个特征峰。在GC-MS研究中也能得到典型的峰对应时间的色谱图样（见fig.
1b）。这些HPLC和GC-MS特征色谱图样被用来标定后续用于动物研究和细胞培养的片仔癀样品。
Fig.2.肝脏切片的电子显微镜照片：(a)空白对照组 小鼠未做任何处理。(b)片仔癀对照组
小鼠仅用片仔癀处理。(c)CCl4试验组 小鼠仅用CCl4处理。(d) CCl4+片仔癀试验组
小鼠先用片仔癀处理再用CCl4处理。注意：片仔癀组(b)显示与空白对照组(a)显示的正常肝脏组织相似，肝细胞排列在聚合于中央静脉(v)的网结平板中。在CCl4组中可观察到在中央静脉(v)周围有一嗜酸区域（粉红色区域）。在这片区域一些细胞将它们的细胞核排斥，只剩嗜酸体。在CCl4+片仔癀肝脏中嗜酸区域面积减少，但在细胞质中还可发现若干液泡。所有切片都用苏木素和伊红染色。Bar=50μm。
动物研究 在空白对照组中小鼠未接受任何处理。肝实质中的肝细胞排列在一厚的细胞网结平板上。肝细胞索从小叶中心静脉向外辐射，两个肝细胞索间有窦状小管（见fig.
2a）。在正常肝细胞只有1.2%细胞核出现异常（见fig. 3）。只处理过片仔癀的小鼠与正常肝脏有相似的结构（见fig.
2b），异常细胞核的比例（3.7%）有轻微的增加（见fig. 3）。在网结平板中肝细胞排列在中心静脉周围，板间窦状小管位置固定。然而在所有CCl4处理过的小鼠中，它们的肝脏在中央小叶地带有明显的组织学异常。（见fig.
2c）。在中心静脉发现带有异常细胞核的扩散褪化细胞。许多这样的细胞在离开小脉周围地区的嗜酸物体时已将它们的细胞核挤出。因此，含有大多数嗜酸性物体和死细胞的粉红色（嗜酸性）区域容易在中央小叶地带观察到。在其它区域许多肝细胞在细胞质鼓起液泡。网状的肝细胞平板结构瓦解，窦状小管毁坏或减少。
细胞核的比例比起空白对照组和片仔癀组有明显增加（46.4%, P<0.01,t-test）（见fig.
3）。淋巴细胞浸润和纤维化并未发现。在片仔癀+CCL4组中正常肝组织部分恢复了（见fig.
2d）。在许多肝小叶检查中，中央静脉周围的粉红色区域明显减轻甚至全部消失，这表明CCL4引起的毒性大大降低了，异常细胞核的比例比起空白对照组和片仔癀组还是较高，但比起CCl4组（见fig.
3）却明显降低了（17.6%, P<0.01, t-test）。在一些小脉周围区域嗜酸物体还能找到。在一些小叶中部分肝细胞平板的网结结构和窦状小管得到恢复。小液泡还在一些肝细胞的细胞质中可观察到。对空白组、CCl4组和CCl4+片仔癀组小鼠的血样的ALT水平进行测量以测定片仔癀是否能保护小鼠肝脏避免四氯化碳引起的损害。正常小鼠血清的ALT值为179.3，而CCl4组的ALT值为1079.8。然而先喂食片仔癀后再用CCl4处理，ALT水平明显降为684.0（P<0.05,t-test,见fig.
4）。
Fig.3.肝脏切片中异常细胞核的比例依次为空白组、片仔癀组、CCl4组、CCl4+片仔癀组。研究者的t-test显示CCl4+片仔癀组比例明显低于CCl4组（P<0.001）。
Fig.4.ALT测量值依次为对照组、CCl4组、CCl4+片仔癀组。研究者的t-test显示CCl4+片仔癀组明显低于CCl4组。
片仔癀对肝细胞增殖的影响 我们研究过片仔癀对肝细胞增殖能力的影响，流程分析显示，在没有片仔癀的情况下，在G0/G1阶段细胞平均数为56±4%，在S阶段细胞平均数为34±3%，在G2/M阶段细胞平均数为10±3%，结果与用500-1000ug/ml片仔癀处理过的细胞进行比较，两者未发现有明显区别(P>0.05Chi-square检验)。
TABLE 1.
_____________________________________________
PTH(ug/ml) G0/G1(%) S(%) G2/M(%)
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0 56±4 34±3 10±3
500 50±3 38±2 12±1
800 52±1 35±3 13±2
1000 52±2 33±3 15±3
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片仔癀处理过的肝细胞传导剖面分析 对片仔癀影响肝细胞中重要信号传导途径的各种反应元素的能力进行了测试。调查研究了反应元素中的AP1、CRE、GRE、HSE、E-box（Myc）、NFκB和NFAT的转录因子。片仔癀（500μg/ml）对E-box
、GRE、HSE和NFAT反应元素无明显作用。然而与对照组（没有加片仔癀的培养剂，见fig.
5）比较，它刺激了AP1、CRE和NFκB反应元素的增长。每一试验重复四次。在所有例子中处理过片仔癀后AP1、CRE和NFκB转录活性与对照组比较有明显增加（P<0.01,Mann-Whitney
U-test）。
在阳性对照组（insert of fig.
5）中，肝细胞通过NFκB反应元素传染且经姜黄素处理。姜黄素是公认的NFκB抑制剂（Singh
&Aggarwal,1995）。在所有3次重复试验中，姜黄素明显抑制了NFκB活性（P<0.01,Mann-Whitney
U-test, insert of fig. 5）。
Fig.5.处理过片仔癀的肝细胞信号转运剖面图。片仔癀刺激AP1、CRE、NFκB反应元素的反应增加。插入：阳性对照显示姜黄素抑制肝细胞中NFκB转录活性。
*P<0.01,Mann-Whitney U-test当同一处理组中数据与对照数据相比较。
讨 论
这次研究中，我们观察到片仔癀具有保护肝脏，免受CCl4损害的能力。组织解剖学显示CCl4能引起肝脏广泛性坏死变化。但在用CCl4处理之前给小鼠喂食片仔癀，这些坏死变化明显减少了。异常细胞核比例从CCl4处理组的46.4%降到CCl4+片仔癀组的17.6%。这些结果表明片仔癀能保护肝脏，免受肝毒性物质的损害。我们的肝功能水平测试也表明片仔癀能保护肝脏。我们发现经CCl4处理后，血清的ALT酶活性处于高水平。相反，小鼠先喂食片仔癀后该指标显著降低了。CCl4引起的肝损伤模型是目前研究传统中成药的保肝作用的最典型动物模型。现在越来越多的中成药声称能够保护肝脏免受CCl4损伤，这些包括Ampelopsis
brevipedunculata,Arctium lappa Linne,Tao Shang
Tsao and Yan Gan Wan.
为了进一步研究片仔癀的治疗作用，我们研究了它对肝细胞的影响。通过细胞培养和流动分析仪揭示片仔癀既不刺激也不抑制肝细胞的增殖。因此可证明片仔癀保护肝脏，免受毒素损害不是通过提高肝细胞增殖能力来实现的。我们也阐明片仔癀有影响重要信号传导途径的（表达因子）反应元素的能力，以便进一步了解它的作用的分子机理。片仔癀不能影响E-box，E-box是c-myc的（表达因子）反应元素。而转录因子c-myc是细胞增殖的强化剂。当它表达出来时，降低了细胞分化能力和增加了细胞进入细胞循环的势能。由于片仔癀并不影响肝细胞增殖，因此片仔癀对E-box无作用是预料之中的。我们发现片仔癀能刺激AP1、CRE和NFκB表达。AP1、NFκB和c-myc是转录因子，它们在细胞众多活动中扮演着重要的调节作用。细胞质的NFκB移位入细胞核经常跟细胞残余物有关系（Foo
& Nolan 1999）。Schrum et al. (2000)报导部分肝切除手术后NFκB的抑制作用显著降低了肝细胞凋落作用和肝功能紊乱。此外，还发现了肝移植强烈上调了细胞核NFκB的表达和当细胞核激活作用被抑制后导致了肝损坏（Bradham
et al. 1999）。因此有可能是片仔癀提升NFκB的能力保护了肝脏免受毒素损害。AP1是转录因子Fos和Jun家族之间形成的异源二聚体（Angel
& Karin 1991）。在肝切除老鼠中c-Jun和c-Fos因直接的早期基因而被转录（Haber
et al. 1993;Weastwick et al. 1995）。Hilberg et
al.（1993）证明转基因小鼠缺乏c-Jun通常在E11.5-15.5死亡并伴随着肝脏生长受损。现在通常认为AP1的活性在肝脏再生中扮演重要角色（Taub
1996;Heim et al. 1997）。现在我们发现片仔癀能刺激AP1表达，这也是它能保护了肝脏免受CCl4引起的损伤的另一个原因。CRE（cAMP（表达因子）反应元素）是转录因子ATF2/CREB（Montminy
& Bilezikjian 1987）的（表达因子）反应元素。还不清楚CRE在肝脏功能中起什么作用。然而它的其中一个功能是清楚的，那就是它能调节老鼠肝脏再生中LDH
A-gene（Lee et al. 1998）。我们的结果显示片仔癀能刺激CRE表达，但我们不清楚里面的关系，所以我们也不清楚片仔癀保护肝脏的能力是否与此相关。
片仔癀和其它传统中药处方一样，是由一些草药或活性成分组成的。复杂的中药配方的使用有助于提高片仔癀治疗作用，这归功于多重成分或药与药之间反应引起的药代动力学和药效学方面的协同作用。这些治疗效果不能另外从单独活性成分得到。同样，我们正确证实片仔癀的不同化学成分之间这种复杂的相互作用的关系。至今知道了麝香是配方中必不可少的成分（Chen
1997; Zhang 1995）。麝香的作用效果包括：促进复苏；恢复意识；促进血循环以减少肿瘤和恢复月经。麝香中三种主要成分被鉴定出来。它们是黄酮类、生物碱和类固醇。麝香酮、去甲麝香酮、是其中的黄酮类成分（Chen
1997;Zhang 1995）。它们中间麝香酮是活性成分，在麝香成分中含0.93%-4.12%。生物碱、麝吡啶碱、羟麝吡啶碱A和羟麝吡啶碱B也在麝香中鉴定出来。5β-雄甾烷-3,17-dione、5α-雄甾烷-3,17-dione、5α-雄甾烷-3β,17α-diol和5α-雄甾烷-3α,17α-diol是发现的类固醇类成分（Chen
1997; Zhang 1995）。
概括地说，我们证实了片仔癀能保护小鼠肝脏，避免四氯化碳引起的肝损害。另外，它能增加肝细胞中重要信号传导途径的（表达因子）反应元素的表达。我们暂时可以推断片仔癀是影响这些传递信号途径的能力而产生保肝作用。
感 谢
作者感谢香港中文大学解剖系M.K.Tang、W.Y.Yan和F.P.Yip的优秀的技术支持。感谢香港科技大学应用生物化学系V.M.L.To女士在GC-MS试验中的帮助。这次研究由创新和技术基金、大学-工业合作计划UIM42、香港SAR政府和漳龙实业有限公司的大力支持。
译者按：本文是香港特区政府要建中药港，旨在使国产中成药通过其自由贸易港的特殊地位走向世界而首批选中的，由特区政府创新基金支持研究的部分内容(这次选中的品种只有两个，片仔癀为唯一被选中的内地品种)。本次主要研究者为David
T.Yew:英国生物学院院士。研究结果出乎专家意料，引起特区政府、海内外专家学者的轰动，为了能及时地与广大的肝炎患者分享这一成果，因此特将分阶段的研究结果发表于丹麦药理毒理杂志上。为了能使国内众多的医药界专家学者、广大的医务工作者、肝炎患者也能分享这一成果，今将其翻译成中文，以飨各位读者。
参考文献
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